今天我們就匯總了一些液相色譜柱使用過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題,并給出針對(duì)性的解決方案。快來(lái)看看是不是問(wèn)到了你的心坎上呢?
問(wèn)題 1:我的液相色譜柱上進(jìn)樣量多少合適,同時(shí)可以避免譜帶展寬?
進(jìn)樣量以及最佳流速受色譜柱尺寸限制。理想情況下,如果樣品與流動(dòng)相使用相同的溶劑,進(jìn)樣量范圍如下:
液相柱內(nèi)徑 ID | 進(jìn)樣量 (µL) |
2.1 mm (30 -100 mm 長(zhǎng)) | 1-3 |
3.0-3.2 mm (50-150 mm 長(zhǎng)) | 2-12 |
4.6 mm (50-250 mm 長(zhǎng)) | 8-40 |
問(wèn)題 2:如果我改用其它尺寸的色譜柱,應(yīng)該如何調(diào)整進(jìn)樣量?
最佳進(jìn)樣量與色譜柱的柱體積相關(guān),因此取決于色譜柱的橫截面積(A = π r2)和長(zhǎng)度(L)。您可以根據(jù)現(xiàn)有方法的進(jìn)樣量估算調(diào)整后的進(jìn)樣量。如果要轉(zhuǎn)換為不同內(nèi)徑(ID)的色譜柱(包裝材料和長(zhǎng)度保持不變),只需將當(dāng)前進(jìn)樣量乘以新舊色譜柱的半徑平方之比即可確定新方法的正確進(jìn)樣量。
例如,如果當(dāng)前在 150 x 4.6 mm 色譜柱上進(jìn)樣量為 20 μL,準(zhǔn)備切換到 150 x 3.0 mm 的色譜柱,則新色譜柱進(jìn)樣量為 20 x (1.52) / (2.32),約為 8.5 μL。
問(wèn)題 3:如果樣品/標(biāo)準(zhǔn)品所使用溶劑比我的初始流動(dòng)相洗脫能力強(qiáng),會(huì)發(fā)生什么情況?
圖 1:溶劑效應(yīng)對(duì)峰形的影響
會(huì)發(fā)生溶劑效應(yīng),通常會(huì)導(dǎo)致峰變形、靈敏度差和保留時(shí)間縮短等問(wèn)題。例如毒物分析中的PFAS 分析中的 PFBA 會(huì)容易受溶劑效應(yīng)影響,因此我們建議使用與初始流動(dòng)相相近的溶劑來(lái)避免溶劑效應(yīng)。如果不便于這樣做,請(qǐng)?jiān)诖_保溶劑與流動(dòng)相可以混溶的前提下盡量減小進(jìn)樣體積來(lái)消弱溶劑效應(yīng)。
問(wèn)題 4:如何確定液相色譜柱的總柱體積或空隙體積?
術(shù)語(yǔ)“色譜柱體積"通常是指空隙體積,它代表二氧化硅顆粒之間的流動(dòng)相體積。空隙體積可以通過(guò)總柱體積( π r2 L)乘以對(duì)應(yīng)色譜柱的裝填系數(shù)來(lái)獲得。對(duì)于全多孔色譜柱,計(jì)算空隙體積(mL)的公式為 V = 0.68 π r2 L,其中 V = 柱體積,單位為 mL;r = 柱截面半徑,單位為厘米;L = 柱長(zhǎng),單位為厘米。對(duì)于表面多孔的色譜柱,例如我們的 Raptor 色譜柱,系數(shù)不同,空隙體積(mL)的公式為 V = 0.50π r2L 。
空隙體積通常通過(guò)進(jìn)特定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定,該標(biāo)準(zhǔn)品需要在待測(cè)色譜柱上無(wú)保留或保留可以忽略不計(jì)。反相色譜柱常用測(cè)試化合物是尿嘧啶。需要注意的是,對(duì)于所使用的特定液相儀器,測(cè)定值還受到柱外死體積的影響,因此可能會(huì)略有不同。
問(wèn)題 5:使用惰性色譜柱有什么好處?哪類(lèi)化合物更適合用 Inert 惰性液相柱分析?
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當(dāng)通過(guò) HPLC 分析金屬敏感化合物時(shí),流路中最大的金屬面積是液相色譜柱的柱管。對(duì)柱管內(nèi)壁進(jìn)行惰性化處理的 Inert 色譜柱,可以消除金屬敏感化合物與金屬之間的非特異性吸附。從而為這類(lèi)化合物提供更好的峰形和響應(yīng)。
這類(lèi)化合物包括:磷酸類(lèi)化合物、酸性化合物、生物分子-蛋白質(zhì)、核苷酸、寡核苷酸等。
圖 2:待測(cè)物與金屬之間的非特異吸附
問(wèn)題 6:分析金屬敏感化合物時(shí),除了使用 Inert 惰性液相柱,我需要鈍化 HPLC 管路嗎?
如果您使用的液相儀器不是惰性 HPLC 系統(tǒng),有可能需要對(duì) HPLC 管路進(jìn)行鈍化,因?yàn)閺倪M(jìn)樣器到色譜柱之間流路中的金屬可能會(huì)對(duì)某些金屬敏感化合物產(chǎn)生一定影響。具體鈍化方法,歡迎您聯(lián)系我們獲取針對(duì)性的幫助。
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